摘要:
基因表达载体构建步骤?某一,质粒载体具有Tetr和Kanf的表现型,在Kan抗性基因内有一Bgl的切点。现在用Bgl切割该载体进行基因克隆?基因表达载体构建步骤?构建步骤:1、用一...
基因表达载体构建步骤?
构建步骤:
2、再用同一种限制酶切断目的基因,使其产生相同的黏性末端;
3、将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处;
4、再使碱基互补配对结合,两个黏性末端吻合在一起,碱基之间形成氢键;
5、再加入适量的DNA连接酶,催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键,从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来,形成一个重组DNA分子。
(图片来源网络,侵删)
基因表达载体构建的步骤如下:
1. 目的基因获取:在进行PCR之前,需要先针对自己的基因设计对应的引物;提取与所需表达的基因同源的细胞或组织中的RNA,并经过RT程序将其转化为cDNA;PCR扩增出所需要的基因片段。
2. 载体构建:载体构建(vector construction)是分子生物学研究常用的手段之一。依赖于限制性核酸内切酶、DNA连接酶和其它修饰酶的作用,分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后,将二者连接在一起,再导入宿主细胞,实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
(图片来源网络,侵删)
3. 挑取克隆提质粒验证:挑取单菌落接种于含载体对应抗性的LB培养液中,200rpm,37℃恒温摇床培养过夜,用质粒小量提取试剂盒提取质粒,再进行双酶切验证、测序验证。
某一,质粒载体具有Tetr和Kanf的表现型,在Kan抗性基因内有一Bgl的切点。现在用Bgl切割该载体进行基因克隆?
成功导入目的基因的载体在加Tetr的培养基上能生长,在加Kanf的培养基上不能生长,即有Tetr抗性没有Kanf抗性(因为Kan抗性基因被Bgl切割破坏了)。
如果在加Tetr的培养基和加Kanf的培养基上都能生长就是没有导入目的基因(你说的插入片段)的普通质粒。